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Rho1D4-专用于膜蛋白的抗体

Rho1D4是指牛视紫红质的细胞内C末端的最后9个氨基酸,它是由与该序列特异性结合的单克隆抗体而命名的。通过与Rho1D4抗体结合,此序列可作为一种高特异性的纯化标签用于膜蛋白的纯化。采用分子生物学方法将目的膜蛋白的C末端加上Rho1D4标签(图1),具有该序列的目的蛋白可被载有rho1D4抗体的亲和基质特异性结合,随后目的蛋白可通过添加过量的Rho1D4肽与基质抗体竞争性结合被洗脱下来,这种洗脱条件比改变pH更加温和。
 
图1:具有3个跨膜结构域的假设膜蛋白,将序列为TETSQVAPA的Rho-1D4标签添加至其C末端。
 
Rho1D4系统介绍
20世纪80年代首次对Rho1D4表位和抗体进行了表征,并通过将抗体与Sepharose®珠子偶联来纯化猴肾细胞中表达的牛视紫红质。此后,Rho1D4系统(标签,抗体偶联亲和基质,洗脱肽)被用于个别膜蛋白的研究,包括G蛋白偶联受体(GPCR),ATP结合转运蛋白,溶质反转运蛋白和四跨膜蛋白。该系统的一个优点是抗体-表位相互作用的高度特异性,而表位的序列和链长对于和抗体的结合是至关重要的。例如,用去除单个甲基的甘氨酸替代第三个丙氨酸可破坏二者的结合。同样,完整的9个氨基酸标签与Rho1D4抗体的结合最紧密,去除2个氨基酸可破坏二者结合。因此,那些含有与Rho1D4表位相似序列的蛋白质的与抗体的非特异性结合可被降低到最小,纯化到的蛋白都有较高的纯度(表格1)。
 
第1步:结合。将带Rho1D4标签的蛋白质与载有Rho1D4抗体的琼脂糖孵育,从裂解物中纯化目的蛋白。
 
第2步:洗涤。洗去杂蛋白和其他裂解物组分,只保留目的蛋白结合在亲和基质上。
 
第3步:洗脱。过量的Rho1D4肽竞争性地结合基质,靶蛋白被洗脱在洗脱液里。
 
Rho1D4系统的优点
Rho1D4系统的另一个优点是较高的目的蛋白回收率。包括细菌,酵母和哺乳动物细胞表达系统,已选择性的对一些GPCR和其他膜蛋白进行了优化。用Rho1D4系统纯化膜蛋白后可通过凝胶过滤层析或离心浓缩来除去洗脱肽。在所有表达系统中,蛋白质的产量都能达到毫克级别(表1)。最后,纯化的蛋白质可用于功能研究,如配体结合的鉴定以及蛋白质间的相互作用。例如,将标记的ABCA4固定在装有Rho1D4抗体的基质上,以鉴定其对天然配体(即视网膜的加合物)的亲和力,然后通过添加ATP来释放。将CD81蛋白整体固定在涂有Rho1D4抗体的平板上,它表现出和分离可溶蛋白片段与丙型肝炎病毒包膜E2蛋白相同的亲和结合力。另外还可通过SPR和放射性标记分析大麻素受体2(CB2)与配体结合,或将CB2重构进脂质体的进行G蛋白活化的测定。最后另外,有阴离子转运载体AE1结构域的重组蛋白被标记且用Rho1D4系统纯化后表现出与红细胞来源的AE1蛋白有相同的硫酸外排速率。
 
蛋白 表达系统 纯度 产量(回收的总蛋白质) 采用的纯化方法
hCB2G蛋白      偶联受体14 大肠杆菌 90% 4.5mg / 5L培养物 Rho1D4 IAC + IMAC
hVN1R1 G蛋白
偶联受体9
诱导型HEK293S
细胞系(哺乳动物)
90% 1毫克/ 1克细胞 Rho1D4 IAC + SEC
FPR3 G蛋白
偶联受体8
诱导型HEK293S
细胞系(哺乳动物)
90% 2毫克/ 6克细胞 Rho1D4 IAC + SEC
TAAR5 G蛋白
偶联受体7
诱导型HEK293S
细胞系(哺乳动物)
90% 1毫克/ 9克细胞 Rho1D4 IAC + SEC
OR131-2 G蛋白
偶联受体5
诱导型HEK293S
细胞系(哺乳动物)
90% 2.9毫克/ 10克细胞 Rho1D4 IAC +离心
hOR17-4 G蛋白
偶联受体11
诱导型HEK293S
细胞系(哺乳动物)
90% 7.5mg / 2.5L培养物 Rho1D4 IAC + SEC
hOR17-4 G蛋白
偶联受体12
无细胞小麦胚芽
提取物
70% 0.3 mg / mL反应溶液 Rho1D4 IAC + SEC
CD81 Tetraspanin
膜蛋白3
诱导型HEK293S
细胞系(哺乳动物)
95% 26微克/ 3×10 ^ 7个细胞 Rho1D4 IAC
AE1
溶质载体6
酿酒酵母菌株BJ5457 93% 2.5mg / 18L培养物 Rho1D4 IAC
表1.文献中报道的用rho1D4系统纯化的膜蛋白的纯度和产率的实例。尽管用Rho1D4系统纯化的许多蛋白质都是G蛋白偶联受体,但该系统也适用于纯化其他膜蛋白(如转运蛋白)。IAC:免疫亲和层析; IMAC:固定化金属亲和层析; SEC:分子排阻色谱。
 
Rho1D4系统入门
由于在异源宿主中表达时,不同的蛋白对于去垢剂及纯化柱的反应各不相同,所以在使用rho1D4系统纯化膜蛋白时需要对一些实验方法进行优化,那么找到所有必须的步骤并制定出最佳的实验方案显得尤为重要。以下4个步骤可帮助您快速有效地运用rho1D4系统纯化目的蛋白。如果需要我们帮助您进行优化,请与我们联系。
第一步,您的目标蛋白需要与Rho1D4标签融合,您可以将此标签带在目的蛋白C-或N-末端,最好选择对蛋白质活性影响最小的位置。
第二步,原核和真核系统在表达目的蛋白时具有不同的优势,需要进行反复试验筛选最佳表达条件以找到合适的表达系统。在细菌系统(大肠杆菌)表达蛋白质需要对宿主,培养基,温度以及诱导时间的进行优化。
第三步,去垢剂用于溶解膜蛋白,选择最佳的去垢剂对目标蛋白后续的纯化至关重要。可对各种常用去垢剂进行筛选。
第四步,纯化Rho1D4标记的蛋白质时,需要与Rho1D4抗体偶联的亲和基质和竞争性洗脱用的Rho1D4肽。
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