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琼脂糖基质简介

什么是琼脂糖珠?
琼脂糖珠是一种水凝胶,具有不同粒径和浓度。琼脂糖由琼脂二糖的重复单元组成,琼脂糖珠通常是交联多孔的,因此蛋白质可以流过珠子的孔隙。琼脂糖珠粒可用于分子排阻或亲和层析,对于亲和层析,配体(如NTA或IDA)与琼脂糖珠聚合物共价连接,可以将带标签的蛋白与其他蛋白分离。琼脂糖基质用于蛋白质的纯化已有几十年的历史,市售的基于琼脂糖的基质种类繁多,不同基质之间的物理性质可能大不相同,我们这篇简短的总结将帮助您找到最佳的产品。
 
Superflow,Sepharose,Agarose的区别
Agarose
PureCube琼脂糖交联度高且在高压下稳定,可与Sepharose和Superflow基质相媲美(见表1)。如果需要高流速和高蛋白质结合能力,新型PureCube 100琼脂糖(用于带His标签蛋白的亲和纯化)是不错的选择。
Sepharose
Sepharose代表的是GE公司不同浓度和大小的交联琼脂糖,其琼脂糖的性质取决于琼脂糖的浓度和交联度,但并非所有该品牌的琼脂糖凝胶基质都适用于FPLC等应用。
Superflow
Superflow是由另外几家公司生产的,指的是高度交联和压力稳定的琼脂糖变体,适用于FPLC实验。Superflow主要用于区分压力稳定的琼脂糖和其他用于批次纯化的交联度较低的琼脂糖。
表1:三种琼脂糖基质的比较
类型 Cube Biotech
“Agarose”
供应商G
“Sepharose”
供应商
Q“Superflow”
材料 高度交联的琼脂糖 高度交联的琼脂糖 高度交联的琼脂糖
琼脂糖浓度 PureCube:7.5%
PureCube 100:6%
定制:4%/ 5%/ 9%
6%/ 4% 4%
孔径大小 中等 中等 中等
平均粒径 PureCube: 40 μm
PureCube 100: 50-150 μm
PureCube XL: 300-500 μm
34 μm(HP)
90 μm(FF)
60-160 μm
线性流量 > 500 cm / h(PureCube)
> 1,000 cm / h(PureCube 100)
> 150 cm/h > 150 cm/h
最大流速 6 ml/min 4或20 ml/min(1或5 ml色谱柱) 20 ml/min
结合能力(带His标签的蛋白质和Ni-NTA) 高达80毫克 高达40毫克 高达50毫克
 
 
图1:交联琼脂糖的化学结构。
 
 
图2:交联琼脂糖在50,000×放大倍数下的扫描电子显微镜照片。照片来源于1995年乌普萨拉大学的Anders S. Medin博士论文。
 
 
 
图3:琼脂糖浓度和交联度对基质孔径和刚性的影响。
A. 低浓度琼脂糖
B. 高浓度、低交联度琼脂糖
C. 高浓度、高交联度琼脂糖
绿线:琼脂糖聚合物;红点:交联处
 
 
图4:用双-ANS染料染色的Cube Biotech琼脂糖珠。本图由德国科隆PAIA Biotech友情提供
 
为什么蛋白质能与琼脂糖珠结合?
琼脂糖珠本身不与蛋白质结合。它们必须与配体(如NTA,谷胱甘肽或抗体)连接,通过特定的相互作用实现蛋白质的纯化。对于亲和层析,最常用的琼脂糖珠是镍-NTA琼脂糖珠。
离子交换色谱
一些官能团如季胺,DEAE,磺丙基或羧甲基等可以与琼脂糖偶联,分别产生强或弱的阴、阳离子交换剂。对于离子交换色谱,蛋白质不需要亲和标签,使得该方法适用于纯化天然来源的蛋白质。
凝胶过滤/分子排阻色谱
交联琼脂糖无需进一步修饰即可用于分子排阻色谱,其分辨率和分离范围取决于琼脂糖的孔径大小。
根据经验,琼脂糖浓度与分离能力的相关性如下:
表2:琼脂糖浓度与蛋白质排阻极限的关系
琼脂糖浓度 蛋白质排阻极限(球状蛋白质)
4% 约30,000 kDa
5% 约10,000 kDa
6% 约4,000 kDa
7.5% 约1,200 kDa
9% 约150 kDa
孔径大小
初始琼脂糖的浓度越高,那么交联后形成的孔径就越小,如果要将琼脂糖用于分子排阻色谱,它的这个特性尤为重要。
压力稳定
初始琼脂糖浓度越高,交联度越高,琼脂糖珠子耐压性越好。
尺寸
琼脂糖具有不同的尺寸和排阻限制,这些特点会影响纯化基质的物理性质。
压力
珠粒越小,蛋白质分离范围越窄,珠粒的耐压性越高。另一方面,珠子越大,批量纯化和FPLC实验中的流速越快。
结合能力
珠子越小,表面积与体积的比值越大,珠子的蛋白结合能力越强。但是,需要注意的是结合能力还取决于其他因素,如配体的类型和大小,以及配体偶联的密度。
动态结合能力
较高流速下纯化柱内会产生压力,使得亲和色谱材料结合蛋白的能力降低,而该效果取决于琼脂糖珠粒大小、琼脂糖含量和交联度。动态结合能力可以告诉我们该琼脂糖材料是否能在高流速下使用而不影响蛋白质的产量。
有关PureCube琼脂糖和其他基质的比较,请参见图5。
 
图5:PureCube琼脂糖比竞争商家90 μm珠粒尺寸琼脂糖具有更高的动态蛋白结合能力。
BSA纯化时使用pH 7.4的Tris缓冲液,采用两种离子交换基质,流速为25-500cm/h,相当于0.8×2.5cm柱的0.3-4.0 ml/min。当流速高于100 cm/h (0.85 ml/min)时,竞争商家基质获得的蛋白质产量显着降低,而PureCube琼脂糖基质即使在500 cm/h (4 ml/ml)的高流速下也显示出可重现的高蛋白质产量)。数据由瑞典BioWorks友情提供。