首页应用阴离子交换层析纯化寡核苷酸
Facebook
WeChat
Twiitter
固相合成的寡核苷酸通常具有较高的初始纯度。然而，对于多种应用场景，尤其是治疗性用途，仍需进一步纯化以去除不完整或错误序列。
理想的纯化方式是组合多种分离技术。常见的组合是疏水相互作用层析与阴离子交换层析联用。阴离子交换层析（AIEX）是一种高效的寡核苷酸纯化技术，即使仅通过一步操作，也能获得高纯度与良好收率。本文采用WorkBeads™ 40Q，对从固相上释放的20个碱基长度的 Trityl-OFF 寡核苷酸进行了纯化。
寡核苷酸
寡核苷酸是脱氧核糖核酸或核糖核酸的短链序列，其骨架上带有磷酸基团，因此带负电荷。通过固相合成法制备的寡核苷酸，其纯度可以非常高。然而，通常仍需进一步纯化，以去除不完整或错误的序列。总会有小比例的寡核苷酸序列存在碱基缺失或插入（例如 N-1 或 N+1，其中 N 为目标寡核苷酸的长度）。合成寡核苷酸的链长越长，失败序列的比例就越高。其中，N-1 污染物通常难以与全长寡核苷酸实现有效分离。
阴离子交换层析
阴离子交换层析（AIEX）能够依据长度差异分离带负电荷的寡核苷酸，因此是寡核苷酸纯化的常用方法。核酸骨架中带负电的磷酸基团，通过AIEX填料上的带正电基团结合到填料上。通常，目标物的结合强度会随其长度增加而增强。吸附的寡核苷酸可通过提高盐浓度梯度进行洗脱，使其按照长度递增的顺序依次释放。
WorkBeads 40Q
WorkBeads 40Q 填料是一种高载量强阴离子交换填料，其衍生化配基为季胺基团。该填料具有高分辨率分离的特性，同时背压低，有利于在生物工艺层析柱中进行纯化。这种基于琼脂糖的填料采用专有方法生产，形成了具有均一粒径分布和卓越机械稳定性的多孔微球。基于琼脂糖的基质与包括蛋白、多肽、核酸和糖类在内的生物分子具有极佳的相容性，因此在从研发到生产规模的生物技术纯化中已成功应用数十年。WorkBeads 40Q 非常适用于寡核苷酸的纯化，可获得高纯度与良好收率。
1. 基于累积体积分布的中值粒径。
2. 在 6.6 × 100 mm 层析柱中，于流速 150 cm/h（留置时间 4 分钟）条件下测定。
实验条件
优化结合与洗脱条件，对于获得高纯度、高产量的全长寡核苷酸纯化工艺至关重要。高分辨率的分离要求填料兼具高效率和良好的选择性。使用分析型层析柱中所采用的小粒径填料可以实现这一目标。然而，由于此类填料会产生较高的背压，并受限于工艺规模层析柱的硬件耐压范围，因此并不适用于大规模纯化。WorkBeads 40Q 的平均粒径为 45 µm，恰好在高分辨率与低背压之间实现了理想的平衡。
我们对比了使用 NaCl 作为洗脱盐，分别在 20 mM Tris-HCl（pH 8）和 20 mM NaOH（pH 12）两种缓冲体系下，对一段 20 个碱基长度的磷酸二酯寡核苷酸（Trityl-OFF）进行梯度洗脱的条件（图 1）。将 1 mg 粗品寡核苷酸样品（从固相载体上释放后，用结合缓冲液按 1:30 稀释）上样至 WorkBeads 40Q 层析柱。该样品中还含有合成步骤中引入的氨和苯甲酰胺杂质。用结合缓冲液洗涤后，采用盐梯度进行洗脱。
填料：WorkBeads 40Q
层析柱：6.6 × 100 mm, 3.4 mL
结合缓冲液：A. 20 mM Tris-HCl, pH 8，20 mM NaOH, pH 12
洗脱缓冲液：A. 20 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 8，B. 20 mM NaOH, 1.5 M NaCl, pH 12
样品：1 mL 浓度为 1 mg/mL 的 20-mer 寡核苷酸（ssDNA，Trityl-OFF）粗品
流速：150 cm/h
梯度：1. 阶跃: 20% 洗脱缓冲液，10 倍柱体积 (CV)；2. 线性: 20% 至 40% 或 50%，20 倍柱体积 (CV)
图1. 在 WorkBeads 40Q 上纯化寡核苷酸，使用 20 mM NaOH（pH 12）（实线蓝色）或 20 mM Tris-HCl（pH 8）（虚线红色）的对比。洗脱梯度以绿色表示：虚线为 20 mM Tris-HCl（pH 8）条件下的 20-40%，实线为 20 mM NaOH（pH 12）条件下的 20-50%。
主峰按 1 mL 每管进行收集。使用 DNAPac™ PA200 分析型阴离子交换层析柱（Thermo Fisher Scientific）对每个收集组分进行纯度分析，并通过比较 A260 吸光度与上样粗品寡核苷酸样品的吸光度来计算收率。图 2 展示了每个组分的纯度、收率及 N-1 杂质的含量。
在洗脱峰的起始部分，N-1 杂质的含量最高。纯度在接近峰中部的区域达到最高，而在后续的组分中，N-1 杂质的含量逐渐降低。根据 DNAPac 的分析结果，两种缓冲体系均能实现全长寡核苷酸与 N-1 杂质的有效分离。在图 1 中，N-1 寡核苷酸在 20 mM NaOH（pH 12）的条件下似乎得到了略微更好的分离效果。
图2. 使用 20 mM NaOH（pH 12）时，主峰内各收集组分的纯度与收率测定结果。柱上方标注了 N-1 杂质的含量%。
为了优化工艺，将选定的 1 mL 组分进行合并，以评估收集方式对收率和纯度的影响，结果见图3。使用 NaOH 缓冲液进行最宽范围收集（7 mL）时，纯度为 95.5%，收率为 76.9%；使用 Tris 缓冲液时，纯度为 95.6%，收率为 74.2%（表 2）。如图 3 所示，采用更窄的收集范围可以获得更高的纯度。
图3. 洗脱主峰在不同收集体积（1 mL、3 mL、5 mL 和 7 mL）下的纯度与收率关系图。条件：(A) 20 mM NaOH，pH 12；(B) 20 mM Tris-HCl，pH 8。
将 WorkBeads 40Q 与竞品进行了纯度和收率的对比。结果表明，WorkBeads 40Q 在纯度和收率两方面均优于竞品，详见表 2。
尽管两根层析柱具有相同的柱效（通过丙酮进样测定），但竞品的主峰宽度却比 WorkBeads 40Q 更宽，具体原因尚不明确。来自客户的数据（未发表）也显示，在两种填料的对比中，当选择合并方式以实现 85% 的收率时，WorkBeads 40Q 可获得 93% 的纯度，而 竞品为 91%。
表2. 收率与纯度对比。比较了 WorkBeads 40Q 与竞品所得主峰的各 1 mL 收集组分（各 7 管）合并后的结果。
根据所得结果可以得出结论：对于该寡核苷酸样品，使用变性条件（20 mM NaOH，pH 12）与非变性条件（20 mM Tris-HCl，pH 8）之间仅存在微小差异。这可能是由于该寡核苷酸缺乏二级结构。对于更容易形成内部结构的长链寡核苷酸，其纯化过程可能会受到变性缓冲液、离液盐以及可能的有机添加剂的更大影响。
动态结合载量的测定
使用前述样品，通过前沿分析在10%穿透点测定动态结合载量（DBC）。在20 mM Tris-HCl（pH 8）缓冲体系中，流速为150 cm/h时，测得动态结合载量为48.3 mg/mL（进样料液浓度：0.1 mg/mL）。图4显示了该寡核苷酸进样料液在WorkBeads 40Q上的穿透曲线。
填料：WorkBeads 40Q
层析柱：6.6 × 100 mm, 3.4 mL
缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 8
样品：0.1 mg/mL 20-mer 寡核苷酸（ssDNA，Trityl-OFF）粗品
流速：150 cm/h
工艺放大纯化
在工艺规模的纯化中，目标通常是在达到预定纯度的前提下，最大化收率。因此，仔细挑选洗脱峰的部分收集组分至关重要。为研究放大条件，将样品上样量设置为填料动态结合载量（DBC）的80%，即向层析柱中上样132 mg寡核苷酸样品。从固相载体合成得到的粗品寡核苷酸样品中含有高浓度的氨和苯甲酰胺，无需进一步调整进样料液的情况下，直接将其上样至层析柱（样品未经稀释）。
图5显示了在样品上样量相当于80%动态结合载量（DBC）的工艺规模纯化运行中，全长寡核苷酸的典型回收曲线。所有组分的吸光度均在260 nm处进行离线测定，以便计算收率（方法与前述低上样量实验相同）。在洗脱梯度开始时，N-x 类物质被洗脱出来，而全长寡核苷酸则在梯度后期开始洗脱。图6色谱图中的柱状图显示了各个收集组分的纯度。这充分证明了全长寡核苷酸得到了有效分离。
填料：WorkBeads 40Q
层析柱：6.6 × 100 mm, 3.4 mL
结合缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 8
洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl pH 8
样品：4.4 mL 浓度为 30 mg/mL 的 20-mer 寡核苷酸 (ssDNA，Trityl-OFF) 粗品
流速：150 cm/h
梯度：线性，0% 至 40%，40 倍柱体积（CV）
图5. 在 WorkBeads 40Q 上，以 80% 动态结合载量（DBC）纯化 20 个碱基长度的寡核苷酸。图中显示了紫外吸光度（蓝线）、洗脱梯度（绿线）以及以 1 mL 组分收集的全长寡核苷酸回收量（红线）。
图6. 上样量为动态结合载量（DBC）80% 的粗品寡核苷酸时，洗脱得到的寡核苷酸峰。各收集组分中全长寡核苷酸的纯度（绿色柱状图）已分别测定。色谱图中显示了所收集组分的合并方案（1–3）。
对洗脱峰的不同合并方案（图6）进行了纯度、收率及N-1杂质含量的分析（表3）。各合并组的体积分别为35、45和55 mL。
脱 盐
离子交换层析之后，在进行后续下游工艺步骤（例如冻干）前，通常需要去除洗脱过程中使用的盐。层析脱盐是一种快速高效的工具，可用于去除盐或不需要的低分子量杂质，或用于缓冲液置换。该技术利用了寡核苷酸与盐之间巨大的分子尺寸差异。大分子的寡核苷酸在柱体积外体积中被洗脱（它们不进入填料颗粒内部），而盐分子则在接近柱总体积时被洗脱（它们进入大部分多孔填料颗粒的内体积，因此被延迟）。我们将洗脱得到的寡核苷酸样品（0.85 mg）上样至脱盐柱（GoBio™ Mini Dsalt 5 mL），以展示脱盐操作的简便与高效。上样体积（1.5 mL）约为柱体积的三分之一。如图7所示，寡核苷酸的紫外吸光度检测曲线与盐的电导率检测曲线互不重叠，表明盐已从寡核苷酸中完全去除。
层析柱：GoBio Mini Dsalt, 5 mL
缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 8
样品：1.5 mL 浓度为 0.57 mg/mL 的经 AIEX 纯化的20-mer 寡核苷酸
流速：5 mL/min
图7. 20个碱基长度寡核苷酸的脱盐。色谱图显示了寡核苷酸（蓝色紫外吸收曲线）与盐（红色电导率曲线）的分离。
结 论
WorkBeads 40Q 是一种高性能填料，非常适用于寡核苷酸的纯化。这种45 µm粒径微球的高刚性特性，使其能够在工艺规模下实现高效纯化。其高动态结合载量减少了工艺时间和所需溶剂体积，从而降低了整体工艺成本。与竞品相比，WorkBeads 40Q 在纯度和收率方面均表现更优。
WorkBeads 40Q 填料还可用于纯化其他类型的核酸，例如：修饰的脱氧核糖核酸、核糖核酸、硫代磷酸酯、磷酸二酰胺吗啉代寡聚物、siRNA、miRNA、mRNA、crRNA/sgRNA等。
理想的纯化方式是组合多种分离技术。常见的组合是疏水相互作用层析与阴离子交换层析联用。阴离子交换层析（AIEX）是一种高效的寡核苷酸纯化技术，即使仅通过一步操作，也能获得高纯度与良好收率。本文采用WorkBeads™ 40Q，对从固相上释放的20个碱基长度的 Trityl-OFF 寡核苷酸进行了纯化。
寡核苷酸
寡核苷酸是脱氧核糖核酸或核糖核酸的短链序列，其骨架上带有磷酸基团，因此带负电荷。通过固相合成法制备的寡核苷酸，其纯度可以非常高。然而，通常仍需进一步纯化，以去除不完整或错误的序列。总会有小比例的寡核苷酸序列存在碱基缺失或插入（例如 N-1 或 N+1，其中 N 为目标寡核苷酸的长度）。合成寡核苷酸的链长越长，失败序列的比例就越高。其中，N-1 污染物通常难以与全长寡核苷酸实现有效分离。
阴离子交换层析
阴离子交换层析（AIEX）能够依据长度差异分离带负电荷的寡核苷酸，因此是寡核苷酸纯化的常用方法。核酸骨架中带负电的磷酸基团，通过AIEX填料上的带正电基团结合到填料上。通常，目标物的结合强度会随其长度增加而增强。吸附的寡核苷酸可通过提高盐浓度梯度进行洗脱，使其按照长度递增的顺序依次释放。
WorkBeads 40Q
WorkBeads 40Q 填料是一种高载量强阴离子交换填料，其衍生化配基为季胺基团。该填料具有高分辨率分离的特性，同时背压低，有利于在生物工艺层析柱中进行纯化。这种基于琼脂糖的填料采用专有方法生产，形成了具有均一粒径分布和卓越机械稳定性的多孔微球。基于琼脂糖的基质与包括蛋白、多肽、核酸和糖类在内的生物分子具有极佳的相容性，因此在从研发到生产规模的生物技术纯化中已成功应用数十年。WorkBeads 40Q 非常适用于寡核苷酸的纯化，可获得高纯度与良好收率。
表1. WorkBeads 40Q 填料特性
2. 在 6.6 × 100 mm 层析柱中，于流速 150 cm/h（留置时间 4 分钟）条件下测定。
实验条件
优化结合与洗脱条件，对于获得高纯度、高产量的全长寡核苷酸纯化工艺至关重要。高分辨率的分离要求填料兼具高效率和良好的选择性。使用分析型层析柱中所采用的小粒径填料可以实现这一目标。然而，由于此类填料会产生较高的背压，并受限于工艺规模层析柱的硬件耐压范围，因此并不适用于大规模纯化。WorkBeads 40Q 的平均粒径为 45 µm，恰好在高分辨率与低背压之间实现了理想的平衡。
我们对比了使用 NaCl 作为洗脱盐，分别在 20 mM Tris-HCl（pH 8）和 20 mM NaOH（pH 12）两种缓冲体系下，对一段 20 个碱基长度的磷酸二酯寡核苷酸（Trityl-OFF）进行梯度洗脱的条件（图 1）。将 1 mg 粗品寡核苷酸样品（从固相载体上释放后，用结合缓冲液按 1:30 稀释）上样至 WorkBeads 40Q 层析柱。该样品中还含有合成步骤中引入的氨和苯甲酰胺杂质。用结合缓冲液洗涤后，采用盐梯度进行洗脱。
填料：WorkBeads 40Q
层析柱：6.6 × 100 mm, 3.4 mL
结合缓冲液：A. 20 mM Tris-HCl, pH 8，20 mM NaOH, pH 12
洗脱缓冲液：A. 20 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 8，B. 20 mM NaOH, 1.5 M NaCl, pH 12
样品：1 mL 浓度为 1 mg/mL 的 20-mer 寡核苷酸（ssDNA，Trityl-OFF）粗品
流速：150 cm/h
梯度：1. 阶跃: 20% 洗脱缓冲液，10 倍柱体积 (CV)；2. 线性: 20% 至 40% 或 50%，20 倍柱体积 (CV)
主峰按 1 mL 每管进行收集。使用 DNAPac™ PA200 分析型阴离子交换层析柱（Thermo Fisher Scientific）对每个收集组分进行纯度分析，并通过比较 A260 吸光度与上样粗品寡核苷酸样品的吸光度来计算收率。图 2 展示了每个组分的纯度、收率及 N-1 杂质的含量。
在洗脱峰的起始部分，N-1 杂质的含量最高。纯度在接近峰中部的区域达到最高，而在后续的组分中，N-1 杂质的含量逐渐降低。根据 DNAPac 的分析结果，两种缓冲体系均能实现全长寡核苷酸与 N-1 杂质的有效分离。在图 1 中，N-1 寡核苷酸在 20 mM NaOH（pH 12）的条件下似乎得到了略微更好的分离效果。
为了优化工艺，将选定的 1 mL 组分进行合并，以评估收集方式对收率和纯度的影响，结果见图3。使用 NaOH 缓冲液进行最宽范围收集（7 mL）时，纯度为 95.5%，收率为 76.9%；使用 Tris 缓冲液时，纯度为 95.6%，收率为 74.2%（表 2）。如图 3 所示，采用更窄的收集范围可以获得更高的纯度。
将 WorkBeads 40Q 与竞品进行了纯度和收率的对比。结果表明，WorkBeads 40Q 在纯度和收率两方面均优于竞品，详见表 2。
尽管两根层析柱具有相同的柱效（通过丙酮进样测定），但竞品的主峰宽度却比 WorkBeads 40Q 更宽，具体原因尚不明确。来自客户的数据（未发表）也显示，在两种填料的对比中，当选择合并方式以实现 85% 的收率时，WorkBeads 40Q 可获得 93% 的纯度，而 竞品为 91%。
表2. 收率与纯度对比。比较了 WorkBeads 40Q 与竞品所得主峰的各 1 mL 收集组分（各 7 管）合并后的结果。
根据所得结果可以得出结论：对于该寡核苷酸样品，使用变性条件（20 mM NaOH，pH 12）与非变性条件（20 mM Tris-HCl，pH 8）之间仅存在微小差异。这可能是由于该寡核苷酸缺乏二级结构。对于更容易形成内部结构的长链寡核苷酸，其纯化过程可能会受到变性缓冲液、离液盐以及可能的有机添加剂的更大影响。
动态结合载量的测定
使用前述样品，通过前沿分析在10%穿透点测定动态结合载量（DBC）。在20 mM Tris-HCl（pH 8）缓冲体系中，流速为150 cm/h时，测得动态结合载量为48.3 mg/mL（进样料液浓度：0.1 mg/mL）。图4显示了该寡核苷酸进样料液在WorkBeads 40Q上的穿透曲线。
填料：WorkBeads 40Q
层析柱：6.6 × 100 mm, 3.4 mL
缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 8
样品：0.1 mg/mL 20-mer 寡核苷酸（ssDNA，Trityl-OFF）粗品
流速：150 cm/h
图4. 结合载量的前沿分析测定
工艺放大纯化
在工艺规模的纯化中，目标通常是在达到预定纯度的前提下，最大化收率。因此，仔细挑选洗脱峰的部分收集组分至关重要。为研究放大条件，将样品上样量设置为填料动态结合载量（DBC）的80%，即向层析柱中上样132 mg寡核苷酸样品。从固相载体合成得到的粗品寡核苷酸样品中含有高浓度的氨和苯甲酰胺，无需进一步调整进样料液的情况下，直接将其上样至层析柱（样品未经稀释）。
图5显示了在样品上样量相当于80%动态结合载量（DBC）的工艺规模纯化运行中，全长寡核苷酸的典型回收曲线。所有组分的吸光度均在260 nm处进行离线测定，以便计算收率（方法与前述低上样量实验相同）。在洗脱梯度开始时，N-x 类物质被洗脱出来，而全长寡核苷酸则在梯度后期开始洗脱。图6色谱图中的柱状图显示了各个收集组分的纯度。这充分证明了全长寡核苷酸得到了有效分离。
填料：WorkBeads 40Q
层析柱：6.6 × 100 mm, 3.4 mL
结合缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 8
洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl pH 8
样品：4.4 mL 浓度为 30 mg/mL 的 20-mer 寡核苷酸 (ssDNA，Trityl-OFF) 粗品
流速：150 cm/h
梯度：线性，0% 至 40%，40 倍柱体积（CV）
对洗脱峰的不同合并方案（图6）进行了纯度、收率及N-1杂质含量的分析（表3）。各合并组的体积分别为35、45和55 mL。
表3. 高上样量运行中不同合并方式对收率与纯度的影响
脱 盐
离子交换层析之后，在进行后续下游工艺步骤（例如冻干）前，通常需要去除洗脱过程中使用的盐。层析脱盐是一种快速高效的工具，可用于去除盐或不需要的低分子量杂质，或用于缓冲液置换。该技术利用了寡核苷酸与盐之间巨大的分子尺寸差异。大分子的寡核苷酸在柱体积外体积中被洗脱（它们不进入填料颗粒内部），而盐分子则在接近柱总体积时被洗脱（它们进入大部分多孔填料颗粒的内体积，因此被延迟）。我们将洗脱得到的寡核苷酸样品（0.85 mg）上样至脱盐柱（GoBio™ Mini Dsalt 5 mL），以展示脱盐操作的简便与高效。上样体积（1.5 mL）约为柱体积的三分之一。如图7所示，寡核苷酸的紫外吸光度检测曲线与盐的电导率检测曲线互不重叠，表明盐已从寡核苷酸中完全去除。
层析柱：GoBio Mini Dsalt, 5 mL
缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 8
样品：1.5 mL 浓度为 0.57 mg/mL 的经 AIEX 纯化的20-mer 寡核苷酸
流速：5 mL/min
结 论
WorkBeads 40Q 是一种高性能填料，非常适用于寡核苷酸的纯化。这种45 µm粒径微球的高刚性特性，使其能够在工艺规模下实现高效纯化。其高动态结合载量减少了工艺时间和所需溶剂体积，从而降低了整体工艺成本。与竞品相比，WorkBeads 40Q 在纯度和收率方面均表现更优。
WorkBeads 40Q 填料还可用于纯化其他类型的核酸，例如：修饰的脱氧核糖核酸、核糖核酸、硫代磷酸酯、磷酸二酰胺吗啉代寡聚物、siRNA、miRNA、mRNA、crRNA/sgRNA等。
