首页白皮书：IEX与RPC在多肽纯化中的兼容性
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多肽作为治疗分子
当前，多肽类药物市场正在迅速扩张，这一增长主要归因于治疗性多肽领域投资的持续增加，以及传染病和代谢性疾病发病率的不断上升。此外，各国政府正在大力支持含多肽类药物的研发，这也被视为多肽应用的一个潜在机遇。与传统生物制剂相比，多肽作为治疗药物的主要优势在于设计更简单、合成成本更低、生物活性高、特异性强且毒性低。然而，制药行业将多肽推向市场仍面临重大挑战，其中许多企业正在采用更环保的多肽合成技术，但成本高于传统方法。所有这些因素都对下游纯化工艺提出了更高要求——高纯度、高收率和更环保的工艺已成为行业追求的目标。
粗品合成多肽料液（固相合成和/或液相合成）含有截短、缺失、异构化和脱保护副产物等杂质。定制多肽通常可合成至50-60个氨基酸，但多肽序列越长，下游纯化工艺中需要去除的失败序列和错误序列就越多。每增加一个保护氨基酸，总体回收率就会降低。即使偶联效率达到99%，一条40个氨基酸长度的多肽收率也仅为约65%。而对于20个氨基酸长度的多肽，预期收率可达约82%（图1）。
图1. 合成多肽面临的挑战。展示了偶联效率为99%时，20-mer、40-mer和100-mer多肽合成的示意图
RPC——唯一的选择？
最常用的多肽纯化方法是反相层析（RPC），通常采用基于C18硅胶的层析柱。对于较大的多肽，如胰岛素，通常首选C4或C8 RPC。单独使用RPC通常可以获得较高的纯度和相对较高的收率，因此在实验室或分析规模的筛选条件下，RPC是首选。但它也存在一些缺点：硅胶骨架较为敏感，且不耐受碱清洗条件，容易被污染。例如，合成过程中产生的疏水性杂质可能积累并不可逆地结合在RPC填料上。此外，RPC在放大时也容易产生极高的背压。同时，它在某些杂质和污染物的分离上存在困难，特别是极性分析物在C18上的分离效果可能较差。
正交性：基于根本不同层析原理的分离
为了规避这些问题，可以在RPC上游采用正交层析步骤，选用更亲水、更极性且能耐受苛刻清洗条件的填料。这样既能满足清洁需求，同时也能实现多肽与杂质的有效分离，从而提高目标物的最终纯度。离子交换层析（IEX）恰好符合这一要求，且与RPC完全正交。RPC依据分子的疏水性进行分离，而IEX则依据分子的电荷差异实现分离。
长期以来人们已经认识到，使用单一的层析方法完全分离复杂混合物中的所有组分极具挑战性。因此，采用一种通用的正交方法十分必要。本白皮书介绍了一种易于实施的IEX方案，该方案可以直接在RPC上游使用，且无需大幅更改缓冲体系即可与现有RPC兼容。
通用简便的IEX方法：0.1% TFA
由于多肽的净电荷随pH变化而变化，其净疏水性也随之变化。因此，洗脱液pH对洗脱顺序和最终选择性有着重要影响。RPC中的一种常见做法是使用强酸作为结合缓冲液，同时它也作为离子对试剂，例如0.1%三氟乙酸（TFA），pH 2。离子对试剂用于增强分析物与配基（如C18）之间的疏水相互作用，并尽量减少混合模式相互作用（如离子相互作用）。如果将RPC的结合缓冲液直接用于IEX的结合缓冲液，则必须使用强阳离子交换剂（CIEX），因为在此pH下，多肽的氨基酸被质子化，呈阳离子状态。采用如此酸性pH的优势在于，即使是序列未知的多肽也能结合到CIEX填料（磺酸基团）的配基上。
流动相中的0.1% TFA并非一个严格的缓冲体系，但足以分离大多数多肽组分。在流动相中添加5-20%的乙腈（ACN）可以防止非特异性疏水相互作用，避免混合模式相互作用，从而进一步增强IEX-RPC联用的正交性。多肽序列中仅需1-2个正电荷（组氨酸、赖氨酸或精氨酸），加上氨基末端的电荷，就足以使其吸附到填料上，这意味着大多数多肽都能结合。根据多肽的等电点，可以调整pH以实现最佳保留——特别是对于碱性较强的多肽，如果pH过低，洗脱可能较为困难。
原理验证
治疗性多肽比伐卢定（Bivalirudin）是一种高效、选择性的凝血酶抑制剂，作为血液稀释剂是肝素的有效替代品。比伐卢定通常仅使用RPC进行纯化，但由于杂质与目标物相似，分离难度较大，纯化效率往往不高。目标多肽序列中含有两个正电荷（精氨酸和氨基末端），且疏水性相对较低，这意味着在低pH条件下，它可以吸附到CIEX填料上。
为验证上述通用IEX-RPC纯化方案的可行性，我们将初始纯度为85%的比伐卢定粗品上样至装有WorkBeads™ 40S（Bio-Works）的层析柱中，流速为150 cm/h（对应留置时间4分钟）。WorkBeads™ 40S是一种基于琼脂糖的强阳离子交换填料，粒径45 µm，孔径小于500 Å。采用小规模层析柱进行上样，以实现目标多肽与杂质之间的最佳分离。
结果仅获得一个对称峰，各多肽组分之间无明显分离。大多数杂质预计在峰的起始和末端部分被洗脱，因此收集了峰的中间部分，排除了起始和末端（见图3A）。收集的4 mL合并液，经分析后，进一步上样至半制备型RPC层析柱（C18 SPS-10，Chromatorex，粒径10 µm，孔径150 Å，图3B）。联用CIEX和RPC这两种正交技术的目标，是获得比单独使用CIEX（图3A）或RPC（图3C）更高的比伐卢定最终纯度。所有收集的组分均使用分析型RPC（ES-C18肽段分析柱，2.1×150 mm，粒径2.7 µm，Ascentis）进行分析。
图3. 比伐卢定粗品分别使用仅CIEX、CIEX-RPC联用或仅RPC的层析纯化图谱。粗品比伐卢定上样至WorkBeads 40S（A），收集标记的组分合并液并进一步在C18 SPS-10上纯化（B）；或仅将粗品比伐卢定上样至C18 SPS-10作为一步纯化步骤（C）。图中215 nm处的紫外吸收曲线为绿色实线，收集的合并液体积为浅绿色区域。
图4. 两步法纯化（IEX-RPC）与一步法纯化（IEX或RPC）的RPC纯度分析。进样料液（A），仅使用C18 SPS-10的洗脱合并液（B），步骤1：WorkBeads 40S洗脱合并液（C），步骤2：WorkBeads 40S与C18 SPS-10联用的洗脱合并液（D）。
对所有洗脱合并液的分析表明，单独使用RPC作为一步纯化时，可获得94.7%的纯度和97%的收率。而CIEX与RPC联用后，在90%的收率下，纯度可接近99%（数据来源于Bio-Works内部实验）。图4显示了各纯化步骤洗脱合并液中纯度与收率的关系。尽管在CIEX纯化中各多肽组分之间没有明显的视觉分离，但分析结果显示粗品样品的纯度显著提高（图5A）。
值得注意的是，那些那些在RPC上分离效果不理想的较早洗脱的杂质，在引入CIEX步骤后得到了显著减少（图5B）。
当IEX与RPC联用时，两者可以分别去除不同类型的杂质，从而实现更高的最终纯度。
图5. CIEX-RPC带来的纯度提升。图中（A）显示每一步纯化后杂质的累积变化。高亮区域显示了与仅使用RPC相比，采用CIEX-RPC方案后杂质峰的去除效果。软件检测到的峰以浅红色填充表示。
结 论——在RPC上游实施IEX的优势
如本白皮书所示，使用与RPC兼容的缓冲液可以轻松建立初始的IEX运行。这两种不同技术的互补性将有助于改善和简化难以分离样品的纯化，尤其是对于极性较强的多肽。若保留与分离性能未达预期，可改用更适合IEX的缓冲液体系，对纯化方案进行调整。乙酸铵是一种合适的缓冲体系，其两个pKa分别为4.75和9.25，因此既可用于CIEX也可用于AIEX，且与RPC兼容。
WorkBeads™ 40S易于放大，同时在工艺规模下增加一个IEX步骤不会显著增加制造成本（上游生产成本仍是主要成本驱动因素，如昂贵的合成化学品等）。除了提高纯度外，IEX作为净化步骤使用的填料可耐受苛刻的清洗条件，因此也能保护硅胶基RPC层析柱。这使得价格更昂贵的RPC填料能够运行更长时间。最后需要指出的是，IEX是一种更环保的技术，通常使用较少的有机溶剂。
在多肽类药物需求持续增长、环保工艺备受重视的当下，IEX与RPC的联用策略为行业提供了一条既高效又可持续的纯化方案。而来自Bio-Works的WorkBeads™ 40S作为这一通用方案中的关键一环，以优异的放大性和耐受性，为多肽纯化提供了一条兼具经济性与可持续性的解决路径。
当前，多肽类药物市场正在迅速扩张，这一增长主要归因于治疗性多肽领域投资的持续增加，以及传染病和代谢性疾病发病率的不断上升。此外，各国政府正在大力支持含多肽类药物的研发，这也被视为多肽应用的一个潜在机遇。与传统生物制剂相比，多肽作为治疗药物的主要优势在于设计更简单、合成成本更低、生物活性高、特异性强且毒性低。然而，制药行业将多肽推向市场仍面临重大挑战，其中许多企业正在采用更环保的多肽合成技术，但成本高于传统方法。所有这些因素都对下游纯化工艺提出了更高要求——高纯度、高收率和更环保的工艺已成为行业追求的目标。
粗品合成多肽料液（固相合成和/或液相合成）含有截短、缺失、异构化和脱保护副产物等杂质。定制多肽通常可合成至50-60个氨基酸，但多肽序列越长，下游纯化工艺中需要去除的失败序列和错误序列就越多。每增加一个保护氨基酸，总体回收率就会降低。即使偶联效率达到99%，一条40个氨基酸长度的多肽收率也仅为约65%。而对于20个氨基酸长度的多肽，预期收率可达约82%（图1）。
RPC——唯一的选择？
最常用的多肽纯化方法是反相层析（RPC），通常采用基于C18硅胶的层析柱。对于较大的多肽，如胰岛素，通常首选C4或C8 RPC。单独使用RPC通常可以获得较高的纯度和相对较高的收率，因此在实验室或分析规模的筛选条件下，RPC是首选。但它也存在一些缺点：硅胶骨架较为敏感，且不耐受碱清洗条件，容易被污染。例如，合成过程中产生的疏水性杂质可能积累并不可逆地结合在RPC填料上。此外，RPC在放大时也容易产生极高的背压。同时，它在某些杂质和污染物的分离上存在困难，特别是极性分析物在C18上的分离效果可能较差。
正交性：基于根本不同层析原理的分离
为了规避这些问题，可以在RPC上游采用正交层析步骤，选用更亲水、更极性且能耐受苛刻清洗条件的填料。这样既能满足清洁需求，同时也能实现多肽与杂质的有效分离，从而提高目标物的最终纯度。离子交换层析（IEX）恰好符合这一要求，且与RPC完全正交。RPC依据分子的疏水性进行分离，而IEX则依据分子的电荷差异实现分离。
图2. IEX和RPC是两种正交的层析技术，分别基于电荷和疏水性分离分子
长期以来人们已经认识到，使用单一的层析方法完全分离复杂混合物中的所有组分极具挑战性。因此，采用一种通用的正交方法十分必要。本白皮书介绍了一种易于实施的IEX方案，该方案可以直接在RPC上游使用，且无需大幅更改缓冲体系即可与现有RPC兼容。
通用简便的IEX方法：0.1% TFA
由于多肽的净电荷随pH变化而变化，其净疏水性也随之变化。因此，洗脱液pH对洗脱顺序和最终选择性有着重要影响。RPC中的一种常见做法是使用强酸作为结合缓冲液，同时它也作为离子对试剂，例如0.1%三氟乙酸（TFA），pH 2。离子对试剂用于增强分析物与配基（如C18）之间的疏水相互作用，并尽量减少混合模式相互作用（如离子相互作用）。如果将RPC的结合缓冲液直接用于IEX的结合缓冲液，则必须使用强阳离子交换剂（CIEX），因为在此pH下，多肽的氨基酸被质子化，呈阳离子状态。采用如此酸性pH的优势在于，即使是序列未知的多肽也能结合到CIEX填料（磺酸基团）的配基上。
流动相中的0.1% TFA并非一个严格的缓冲体系，但足以分离大多数多肽组分。在流动相中添加5-20%的乙腈（ACN）可以防止非特异性疏水相互作用，避免混合模式相互作用，从而进一步增强IEX-RPC联用的正交性。多肽序列中仅需1-2个正电荷（组氨酸、赖氨酸或精氨酸），加上氨基末端的电荷，就足以使其吸附到填料上，这意味着大多数多肽都能结合。根据多肽的等电点，可以调整pH以实现最佳保留——特别是对于碱性较强的多肽，如果pH过低，洗脱可能较为困难。
- 结合条件（流动相A）：0.1% TFA，5-20% ACN
- 洗脱条件（流动相B）：0.1% TFA，5-20% ACN，1M NaCl
原理验证
治疗性多肽比伐卢定（Bivalirudin）是一种高效、选择性的凝血酶抑制剂，作为血液稀释剂是肝素的有效替代品。比伐卢定通常仅使用RPC进行纯化，但由于杂质与目标物相似，分离难度较大，纯化效率往往不高。目标多肽序列中含有两个正电荷（精氨酸和氨基末端），且疏水性相对较低，这意味着在低pH条件下，它可以吸附到CIEX填料上。
为验证上述通用IEX-RPC纯化方案的可行性，我们将初始纯度为85%的比伐卢定粗品上样至装有WorkBeads™ 40S（Bio-Works）的层析柱中，流速为150 cm/h（对应留置时间4分钟）。WorkBeads™ 40S是一种基于琼脂糖的强阳离子交换填料，粒径45 µm，孔径小于500 Å。采用小规模层析柱进行上样，以实现目标多肽与杂质之间的最佳分离。
结果仅获得一个对称峰，各多肽组分之间无明显分离。大多数杂质预计在峰的起始和末端部分被洗脱，因此收集了峰的中间部分，排除了起始和末端（见图3A）。收集的4 mL合并液，经分析后，进一步上样至半制备型RPC层析柱（C18 SPS-10，Chromatorex，粒径10 µm，孔径150 Å，图3B）。联用CIEX和RPC这两种正交技术的目标，是获得比单独使用CIEX（图3A）或RPC（图3C）更高的比伐卢定最终纯度。所有收集的组分均使用分析型RPC（ES-C18肽段分析柱，2.1×150 mm，粒径2.7 µm，Ascentis）进行分析。
对所有洗脱合并液的分析表明，单独使用RPC作为一步纯化时，可获得94.7%的纯度和97%的收率。而CIEX与RPC联用后，在90%的收率下，纯度可接近99%（数据来源于Bio-Works内部实验）。图4显示了各纯化步骤洗脱合并液中纯度与收率的关系。尽管在CIEX纯化中各多肽组分之间没有明显的视觉分离，但分析结果显示粗品样品的纯度显著提高（图5A）。
值得注意的是，那些那些在RPC上分离效果不理想的较早洗脱的杂质，在引入CIEX步骤后得到了显著减少（图5B）。
图5. CIEX-RPC带来的纯度提升。图中（A）显示每一步纯化后杂质的累积变化。高亮区域显示了与仅使用RPC相比，采用CIEX-RPC方案后杂质峰的去除效果。软件检测到的峰以浅红色填充表示。
结 论——在RPC上游实施IEX的优势
如本白皮书所示，使用与RPC兼容的缓冲液可以轻松建立初始的IEX运行。这两种不同技术的互补性将有助于改善和简化难以分离样品的纯化，尤其是对于极性较强的多肽。若保留与分离性能未达预期，可改用更适合IEX的缓冲液体系，对纯化方案进行调整。乙酸铵是一种合适的缓冲体系，其两个pKa分别为4.75和9.25，因此既可用于CIEX也可用于AIEX，且与RPC兼容。
WorkBeads™ 40S易于放大，同时在工艺规模下增加一个IEX步骤不会显著增加制造成本（上游生产成本仍是主要成本驱动因素，如昂贵的合成化学品等）。除了提高纯度外，IEX作为净化步骤使用的填料可耐受苛刻的清洗条件，因此也能保护硅胶基RPC层析柱。这使得价格更昂贵的RPC填料能够运行更长时间。最后需要指出的是，IEX是一种更环保的技术，通常使用较少的有机溶剂。
在多肽类药物需求持续增长、环保工艺备受重视的当下，IEX与RPC的联用策略为行业提供了一条既高效又可持续的纯化方案。而来自Bio-Works的WorkBeads™ 40S作为这一通用方案中的关键一环，以优异的放大性和耐受性，为多肽纯化提供了一条兼具经济性与可持续性的解决路径。
