首页Protein A 层析中的洗脱两难困境
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引 言
Protein A层析是抗体纯化工艺中常用的标准捕获方式，具有高选择性和良好的可放大性。然而，由于低pH可能会使抗体变得不稳定并造成聚集，因此在抗体洗脱的过程中所需要的酸性条件就带来了一些挑战。
在本研究中，针对一种易聚集的单克隆抗体（Antibody X）的纯化，考察了洗脱pH和缓冲液化学组分对抗体聚集及洗脱行为的影响。使用Bio-Works提供的Protein A填料：WorkBeads™ affimAb Edge 评估了不同洗脱条件，并通过排阻层析（SEC）的方式，分析了聚集水平。
研究结果表明，pH越低，抗体的聚集情况就越严重，而缓冲液体系的选择对洗脱曲线有着显著的影响。与甘氨酸-盐酸（glycine-HCl）相比，柠檬酸盐（Citrate）缓冲液可实现更均匀的pH过渡，并产生更窄的洗脱峰。在所测试的条件中，pH 3.5的柠檬酸盐缓冲液在洗脱效率、峰形和聚集控制之间提供了最佳平衡。在此优化条件下，与广泛使用的商业化 Protein A填料相比，WorkBeads™ affimAb Edge 实现了更高的收率和更低的聚集体水平，证明其适用于高效纯化易聚集的单克隆抗体。
抗体纯化中的挑战
单克隆抗体（mAb）、双特异性抗体以及含Fc片段的抗体衍生物，凭借其靶向特异性，已成为多种疾病治疗方案的基石。不仅如此，这种精准的识别能力也让它们成为诊断试剂盒开发及各类生物分子检测中的关键工具。
正是由于治疗性抗体对靶向选择性的极高要求，其纯度标准也极为严苛。因此，开发高效且经济的纯化工艺，成为整个生产流程中的核心环节。
在现行的纯化策略中，Protein A层析凭借其出色的特异选择性和工艺稳健性，被公认为抗体纯化步骤的“金标准”。但需要注意的是，它也是整个工艺中成本最高的单一耗材，且极易因杂质污染和反复清洗而出现载量衰减。因此，Protein A捕获步骤往往成为工艺优化中最具潜力的突破口。
近年来，上游细胞培养技术的不断进步大幅提升了单抗的表达量，但这同时也给下游纯化带来了更大挑战——不仅对填料载量提出了更高要求，对去除杂质能力的要求也显著提高。在需要重点清除的杂质中，宿主细胞核酸（如DNA和RNA）、宿主细胞蛋白（HCP）、病毒颗粒以及抗体聚集体，均有可能在患者体内引发严重的免疫反应，也正因如此，在纯化过程中，这些杂质必须被有效且严格地去除。
这其中，抗体聚集体的控制尤为棘手。更高的产物浓度通常意味着更高的产量，但这同时也伴随着聚集体形成风险的显著增加。更值得关注的是，现代高载量Protein A填料在结合表面形成的局部蛋白浓度远高于传统填料，这一特性在提升载量的同时，也可能进一步造成聚集体的生成。此外，洗脱步骤中必需的酸性条件本身也是一个已知的促聚集因素——当高载量、高浓度与低pH环境三者叠加时，聚集问题就变得尤为突出。
除了纯度和安全性的硬性要求，日益严格的可持续发展目标也在推动工艺变革。这意味着，纯化工艺不仅要在性能上达标，还必须全面优化缓冲液消耗、填料用量、生产效率和整体成本。
综上所述，面对这些多方面的挑战，现代抗体纯化工艺迫切需要一种兼具高性能、高稳健性与高度灵活性的Protein A填料——它必须能够承受高流速和大上样量的操作强度，同时在整个使用寿命内始终如一地保证产品的质量和安全性。
WorkBeads™ affimAb Edge
WorkBeads™ affimAb Edge 是affimAb系列的新一代抗体纯化填料，专为从实验室到生产规模的单克隆抗体及任何含Fc片段或融合产物的高效纯化而设计的。该填料旨在提供最佳的纯化性能，在4分钟留置时间下动态结合载量（DBC）> 60 mg/mL，在6分钟留置时间下> 70 mg/mL。
这款改进型填料采用新型琼脂糖基质，形成具有均一孔径分布和极高机械稳定性的多孔微球。该填料在耐碱Protein A配基的偶联密度上经过了精心优化，WorkBeads™ affimAb Edge在提升动态结合载量（DBC）的同时，还带来了出色的压力-流速表现，这意味着在工艺放大或高通量纯化中，无需担心背压过高而限制流速。这些特点共同带来了更快的处理速度、更小的洗脱体积以及在多次纯化循环中的稳定性能。
WorkBeads™ affimAb Edge 不仅提供高载量、高回收率和高纯度，更重要的是将这三者有机整合，使整个纯化工艺在保证质量的同时，实现更高的通量和更低的综合运行成本。
单抗纯化平台
在抗体纯化工艺中，Protein A层析凭借其出色的特异选择性、工艺稳健性和可放大性，已成为捕获步骤的行业标准。单是这一步，通常就能将抗体纯度提升至95%以上。
1. 基于累积体积分布的中值粒径。
2. 动态结合载量通过穿透曲线分析（10% 穿透值，QB10%）测定。测试条件：使用填充 WorkBeads affimAb Edge 的层析柱（柱床尺寸 5 × 100 mm），以 1 mg/mL 人 IgG（溶于 PBS，pH 7.4）为样品，流速 0.33 mL/min（100 cm/h，对应留置时间 6 分钟）。
3. 使用水性缓冲液在 20°C 下的推荐流速。若液体粘度较高，应降低最大流速。低温可能导致粘度升高（在 4°C 下操作时，建议使用最大流速的一半），或由添加剂引起（例如，使用 20% 乙醇时，建议采用最大流速的一半）。
4. 推荐流速使用 10 × 200 mm 层析柱测定。
捕获之后，通常还需要一步或两步精纯步骤，以去除残留的杂质和聚集体，使最终产品达到质量放行标准。在经典的三步纯化流程中，第一步精纯通常采用阴离子交换层析（AIEX），主要用于去除宿主细胞DNA（HCD）、病毒以及部分宿主细胞蛋白（HCP）。后续的聚集体和剩余的HCP，则通过第二步精纯——阳离子交换层析（CIEX）——完成最终清除。
对于某些纯化难度较大的单抗，可以考虑在Protein A柱上游增加一个预处理柱（例如以穿流模式运行的WorkBeads 40 TREN），以改善进料质量。这一前置步骤能够显著降低进入Protein A柱的杂质负载，不仅能提高进料的纯度，还能显著有效延长Protein A填料的使用寿命，提升其整体处理能力。关于这种改进型三步纯化策略的更多细节，可参见Bio-Works的官方网站：www.bio-works.com
洗脱难题
在Protein A层析过程中，聚集体形成是一个固有且不容忽视的挑战，因为洗脱过程必然会涉及到pH的显著降低——通常在2.7至3.5之间。在如此低的pH条件下，Protein A本身也会发生构象变化，从而削弱配基与抗体Fc域之间的结合力，实现目标抗体的释放。然而，这也带来一个典型的“洗脱两难困境”：pH必须足够低才能有效洗脱抗体，但过低的pH又会对抗体的结构稳定性造成冲击，反而诱发聚集。
当pH降至4.0以下时，维持抗体天然构象的多种关键作用力——包括氢键和盐桥——都会受到不同程度的破坏。这种破坏会导致抗体分子内部及结构域之间的相互作用被削弱，使其构象变得更加灵活，甚至发生局部去折叠。一旦去折叠发生，通常被包裹在分子内部的疏水域便会暴露出来，进而促使抗体分子之间发生诸多非天然的不可控相互作用，这种相互作用可能成为聚集的起点，并逐步发展成为可见的聚集体。
此外，洗脱过程中还有一个不可忽视的因素：抗体浓度非常高，而高浓度本身就是促进聚集的推手之一。因为浓度越高，分子之间发生疏水碰撞的概率就越大。虽然酸性洗脱在Protein A层析中不可避免，但这一步骤在整个纯化流程中风险极高——如果不能精确控制条件，很可能诱发大量聚集体的生成。对于治疗性抗体而言，这个问题尤为严重。因为聚集体不仅会降低药物的生物活性，还可能在被注入患者体内后，引发严重的免疫原性反应，一旦残留，将构成重大的安全隐患。
为了深入理解聚集体的形成机制并探索其抑制策略，本研究以Antibody X——一种已知特别容易聚集的单克隆抗体为模型分子，系统评估了不同洗脱条件下对其聚集行为的影响（表1，图1）。
本研究中的所有实验均采用高性能Protein A填料WorkBeads affimAb Edge，在标准操作条件下进行，上样量为填料动态结合载量（DBC）的70%。Antibody X的样品来源为澄清的CHO细胞上清液，抗体浓度约为5 mg/mL。洗脱液中的聚集体含量通过分析型排阻层析（SEC）对各收集组分进行检测，并以高分子量物质（HMWS）的百分比进行定量评估。
洗脱pH的影响
为了找出最适合Antibody X的洗脱条件，我们首先在pH 2.7至4.0的范围内进行了一系列测试。如图2所示，实验结果符合预期：pH越低，洗脱液中高分子量物质（HMWS）的比例越高，即聚集体水平越高；而随着pH升高，HMWS水平呈下降趋势。
除了聚集体水平，洗脱峰宽也是衡量洗脱效率的重要指标之一。窄的洗脱峰意味着目标蛋白集中在一个较小的体积范围内被回收，后续处理更省时省力。理论上，pH越低，洗脱强度越大，峰形应当更窄。实验中pH 4.0的峰形确实呈现出明显的宽化和拖尾——很可能是酸性不足导致抗体未能从Protein A上彻底释放所致。
但有趣的是，pH 3.5与pH 2.7的表现并未完全遵循这一规律。pH 3.5的洗脱峰不仅比pH 2.7更窄，而且HMWS水平也更低。也就是说，在本次实验中，pH 3.5同时兼顾了高效的洗脱和较低的聚集风险，是一个更理想的操作条件。这也引出了一个值得深思的问题：为什么在这个案例中，pH 3.5反而比酸性更强的pH 2.7表现更好？
图3. 缓冲液和 pH 对单抗洗脱的影响，使用 (A) 柠檬酸盐缓冲液和 (B) 甘氨酸-HCl，pH 分别为 3.0、3.2 和 3.5。(C) 相应洗脱的收率和 HMWS 水平。
机理洞察
为了进一步厘清影响峰形、聚集体水平和收率的深层因素，我们在后续实验中引入了另一种缓冲体系——甘氨酸-HCl（glycine-HCl），并与柠檬酸盐（Citrate）缓冲液在pH 3.0、3.2和3.5下进行了系统对比（图3）。
有趣的是，两种缓冲体系下的峰形变化趋势正好相反：柠檬酸盐缓冲液的峰形随pH升高而逐渐变窄；而甘氨酸-HCl则恰恰相反，随pH升高反而出现峰宽化（图3A）。
在HMWS水平方面，两种缓冲液的表现均符合“低pH高聚集”的总体趋势，即pH越高，HMWS水平越低。但值得注意的是，在相同pH条件下，柠檬酸盐缓冲液产生的HMWS水平略高于甘氨酸-HCl。这可能与两种缓冲液体系下洗脱总体积不同有关——洗脱体积的大小直接影响了收集液中抗体的浓度，进而可能影响聚集体的生成（图3B）。
那么，为什么会出现完全相反的峰形变化趋势呢？
对于柠檬酸盐缓冲液而言，峰宽化与HMWS水平的升高密切相关。通过对洗脱峰的逐管分析（图4）可以发现，HMWS主要在峰的拖尾区域富集。一个可能的解释是：较低pH下产生的聚集体更多，而这些高分子量复合物在层析柱中迁移较慢，更容易滞留在峰尾，从而导致峰形不对称地展宽。
而甘氨酸-HCl的峰形变化则与其缓冲体系本身的特性有关。在Protein A层析中，pH降低是洗脱的主要驱动力，因此pH过渡的方式直接影响洗脱效率。当洗脱缓冲液进入层析柱后，大约在0.9倍柱体积时突破，pH和电导率随之发生变化。监测pH和电导率的动态过程，可以观察到柠檬酸盐和甘氨酸-HCl两种缓冲液在柱内传播方式的显著差异。
图4. 使用柠檬酸盐缓冲液在 pH (A) 3.0、(B) 3.2 和 (C) 3.5 下对单抗洗脱进行组分分析。蓝色线代表 UV 信号，红色和绿色柱分别代表 HMWS 和单体水平，黑色线代表总收率。
结果讨论
对于柠檬酸盐而言，在洗脱峰的早期阶段，pH的变化与电导率的下降几乎同步（如图4A中pH 3.5的柠檬酸盐所示）。这表明洗脱缓冲液以相对均匀的方式通过层析柱，pH下降平稳、可控，抗体得以迅速解吸，形成窄且对称的洗脱峰。
相比之下，甘氨酸-HCl的表现则截然不同（图5）。洗脱缓冲液突破后，pH并非立即下降，而是出现一个“过冲”——先升高至碱性区域（>7.4），随后才缓慢回落至目标pH。与此同时，电导率则先降后升，整体变化曲线呈现出明显的时间滞后。
图5. 使用 (A) pH 3.5 柠檬酸盐缓冲液和 (B) pH 3.0（浅红色）和 3.5（红色）甘氨酸-HCl 对单抗洗脱的缓冲液和 pH 依赖性。监测 UV（实线）、pH（虚线）和电导率（点线）。
这种滞后现象与甘氨酸的化学特性有关。在过冲阶段的高pH条件下（>7.4），甘氨酸主要以两性离子形式存在，对电导率的贡献极小；当pH逐渐稳定至目标值（3.0或3.5）时，甘氨酸被质子化，电导率随之小幅上升——这种效应在更低pH下更为明显。
进一步分析认为，pH过冲可能是由甘氨酸阳离子与Protein A配基上带负电残基结合的钠离子之间发生离子交换所致[1]。这种相互作用延缓了pH前沿在柱内的传播。同时，甘氨酸-HCl在目标pH范围内的缓冲能力较弱，进一步拉长了pH平衡所需的时间。pH下降的延迟直接导致抗体解吸延迟，洗脱峰随之宽化。而在更高pH下，甘氨酸-HCl的缓冲能力更弱，过冲现象更严重，峰形也更宽——这正好解释了图3B中pH 3.5比pH 3.0表现更差的原因。
综合以上结果，我们最终选择pH 3.5的柠檬酸盐缓冲液作为Antibody X的最优洗脱条件。这一条件不仅洗脱峰形最窄、收率高，而且HMWS水平适中，可在后续精纯步骤中有效去除。
Protein A 填料的性能比较
在确定了pH 3.5柠檬酸盐缓冲液为最优洗脱条件后，我们进一步对比了WorkBeads™ affimAb Edge与另外两款市售Protein A填料——MP和MS70——在纯化Antibody X时的整体表现。
结果显示，三种填料在洗脱峰形上并无显著差异，均表现出良好的洗脱效率。但在对洗脱液的进一步分析时发现，WorkBeads™ affimAb Edge在关键指标上具有明显优势。
从SEC图谱（图6A）来看，三种填料的洗脱液中均以单体为主，说明目标抗体得到了有效捕获和回收。其中，WorkBeads™ affimAb Edge洗脱液中的高分子量物质（HMWS）水平最低（图6B），表明其在捕获阶段对抗体聚集的控制更为出色。在收率方面，三种填料均达到了90%以上的高回收率（图6C），但WorkBeads™ affimAb Edge的收率超过95%，且在SDS-PAGE分析中展现出最高的纯度（图6D）。
综合来看，三种填料在洗脱峰形上旗鼓相当，但在洗脱液的最终品质上，WorkBeads™ affimAb Edge提供了更高的收率、更低的HMWS水平和更好的纯度，这使其在提升抗体纯化工艺的生产效率和产品质量方面具备实实在在的潜力。
图6. 使用pH 3.5柠檬酸盐作为洗脱缓冲液纯化Antibody X时，WorkBeads affimAb Edge（蓝色）、MP（红色）和MS70（绿色）的比较评估。(A) 分析型SEC图谱，(B) 收率与HMWS分析，(C) 洗脱单抗合并液的SDS-PAGE。
结 论
洗脱缓冲液的选择和pH设定，对Protein A亲和层析的整体表现有着举足轻重的影响——这两者共同决定了聚集体水平和洗脱峰形这两个核心指标。而贯穿其中的核心矛盾，正是我们在本文中反复提及的“洗脱两难困境”：必须使用足够低的pH才能有效释放抗体，但低pH本身又会不可避免地促进抗体聚集。
本研究以易聚集单抗Antibody X为模型，系统评估了不同洗脱条件的影响。结果表明，低pH确实会加剧聚集；同时，缓冲液的化学组分并非中性角色——它会显著影响pH在柱内的传播方式，进而改变洗脱曲线的形态。柠檬酸盐缓冲液能提供均匀的pH过渡和窄而对称的洗脱峰，而甘氨酸-HCl则因pH过冲和传播延迟，导致峰形宽化。
在这一优化条件下，来自Bio-Works的WorkBeads™ affimAb Edge与市售Protein A填料MP和MS70相比，WorkBeads™ affimAb Edge不仅收率更高，HMWS水平也更低。
这些结果充分说明，WorkBeads™ affimAb Edge能够在保证高回收率的同时，更有效地抑制抗体聚集，为单抗纯化工艺带来更高的生产效率和更好的成本效益。
订购信息
参考文献
1. Hahn R, Berger L, Beck J, Carta G. pH and conductivity transients during elution of IgG from protein A columns. Biotechnology Progress. 2025 May-Jun;41(3):e3534. doi: 10.1002/btpr.3534.
Protein A层析是抗体纯化工艺中常用的标准捕获方式，具有高选择性和良好的可放大性。然而，由于低pH可能会使抗体变得不稳定并造成聚集，因此在抗体洗脱的过程中所需要的酸性条件就带来了一些挑战。
在本研究中，针对一种易聚集的单克隆抗体（Antibody X）的纯化，考察了洗脱pH和缓冲液化学组分对抗体聚集及洗脱行为的影响。使用Bio-Works提供的Protein A填料：WorkBeads™ affimAb Edge 评估了不同洗脱条件，并通过排阻层析（SEC）的方式，分析了聚集水平。
研究结果表明，pH越低，抗体的聚集情况就越严重，而缓冲液体系的选择对洗脱曲线有着显著的影响。与甘氨酸-盐酸（glycine-HCl）相比，柠檬酸盐（Citrate）缓冲液可实现更均匀的pH过渡，并产生更窄的洗脱峰。在所测试的条件中，pH 3.5的柠檬酸盐缓冲液在洗脱效率、峰形和聚集控制之间提供了最佳平衡。在此优化条件下，与广泛使用的商业化 Protein A填料相比，WorkBeads™ affimAb Edge 实现了更高的收率和更低的聚集体水平，证明其适用于高效纯化易聚集的单克隆抗体。
抗体纯化中的挑战
单克隆抗体（mAb）、双特异性抗体以及含Fc片段的抗体衍生物，凭借其靶向特异性，已成为多种疾病治疗方案的基石。不仅如此，这种精准的识别能力也让它们成为诊断试剂盒开发及各类生物分子检测中的关键工具。
正是由于治疗性抗体对靶向选择性的极高要求，其纯度标准也极为严苛。因此，开发高效且经济的纯化工艺，成为整个生产流程中的核心环节。
在现行的纯化策略中，Protein A层析凭借其出色的特异选择性和工艺稳健性，被公认为抗体纯化步骤的“金标准”。但需要注意的是，它也是整个工艺中成本最高的单一耗材，且极易因杂质污染和反复清洗而出现载量衰减。因此，Protein A捕获步骤往往成为工艺优化中最具潜力的突破口。
近年来，上游细胞培养技术的不断进步大幅提升了单抗的表达量，但这同时也给下游纯化带来了更大挑战——不仅对填料载量提出了更高要求，对去除杂质能力的要求也显著提高。在需要重点清除的杂质中，宿主细胞核酸（如DNA和RNA）、宿主细胞蛋白（HCP）、病毒颗粒以及抗体聚集体，均有可能在患者体内引发严重的免疫反应，也正因如此，在纯化过程中，这些杂质必须被有效且严格地去除。
这其中，抗体聚集体的控制尤为棘手。更高的产物浓度通常意味着更高的产量，但这同时也伴随着聚集体形成风险的显著增加。更值得关注的是，现代高载量Protein A填料在结合表面形成的局部蛋白浓度远高于传统填料，这一特性在提升载量的同时，也可能进一步造成聚集体的生成。此外，洗脱步骤中必需的酸性条件本身也是一个已知的促聚集因素——当高载量、高浓度与低pH环境三者叠加时，聚集问题就变得尤为突出。
除了纯度和安全性的硬性要求，日益严格的可持续发展目标也在推动工艺变革。这意味着，纯化工艺不仅要在性能上达标，还必须全面优化缓冲液消耗、填料用量、生产效率和整体成本。
综上所述，面对这些多方面的挑战，现代抗体纯化工艺迫切需要一种兼具高性能、高稳健性与高度灵活性的Protein A填料——它必须能够承受高流速和大上样量的操作强度，同时在整个使用寿命内始终如一地保证产品的质量和安全性。
WorkBeads™ affimAb Edge
WorkBeads™ affimAb Edge 是affimAb系列的新一代抗体纯化填料，专为从实验室到生产规模的单克隆抗体及任何含Fc片段或融合产物的高效纯化而设计的。该填料旨在提供最佳的纯化性能，在4分钟留置时间下动态结合载量（DBC）> 60 mg/mL，在6分钟留置时间下> 70 mg/mL。
这款改进型填料采用新型琼脂糖基质，形成具有均一孔径分布和极高机械稳定性的多孔微球。该填料在耐碱Protein A配基的偶联密度上经过了精心优化，WorkBeads™ affimAb Edge在提升动态结合载量（DBC）的同时，还带来了出色的压力-流速表现，这意味着在工艺放大或高通量纯化中，无需担心背压过高而限制流速。这些特点共同带来了更快的处理速度、更小的洗脱体积以及在多次纯化循环中的稳定性能。
WorkBeads™ affimAb Edge 不仅提供高载量、高回收率和高纯度，更重要的是将这三者有机整合，使整个纯化工艺在保证质量的同时，实现更高的通量和更低的综合运行成本。
单抗纯化平台
在抗体纯化工艺中，Protein A层析凭借其出色的特异选择性、工艺稳健性和可放大性，已成为捕获步骤的行业标准。单是这一步，通常就能将抗体纯度提升至95%以上。
2. 动态结合载量通过穿透曲线分析（10% 穿透值，QB10%）测定。测试条件：使用填充 WorkBeads affimAb Edge 的层析柱（柱床尺寸 5 × 100 mm），以 1 mg/mL 人 IgG（溶于 PBS，pH 7.4）为样品，流速 0.33 mL/min（100 cm/h，对应留置时间 6 分钟）。
3. 使用水性缓冲液在 20°C 下的推荐流速。若液体粘度较高，应降低最大流速。低温可能导致粘度升高（在 4°C 下操作时，建议使用最大流速的一半），或由添加剂引起（例如，使用 20% 乙醇时，建议采用最大流速的一半）。
4. 推荐流速使用 10 × 200 mm 层析柱测定。
对于某些纯化难度较大的单抗，可以考虑在Protein A柱上游增加一个预处理柱（例如以穿流模式运行的WorkBeads 40 TREN），以改善进料质量。这一前置步骤能够显著降低进入Protein A柱的杂质负载，不仅能提高进料的纯度，还能显著有效延长Protein A填料的使用寿命，提升其整体处理能力。关于这种改进型三步纯化策略的更多细节，可参见Bio-Works的官方网站：www.bio-works.com
洗脱难题
在Protein A层析过程中，聚集体形成是一个固有且不容忽视的挑战，因为洗脱过程必然会涉及到pH的显著降低——通常在2.7至3.5之间。在如此低的pH条件下，Protein A本身也会发生构象变化，从而削弱配基与抗体Fc域之间的结合力，实现目标抗体的释放。然而，这也带来一个典型的“洗脱两难困境”：pH必须足够低才能有效洗脱抗体，但过低的pH又会对抗体的结构稳定性造成冲击，反而诱发聚集。
当pH降至4.0以下时，维持抗体天然构象的多种关键作用力——包括氢键和盐桥——都会受到不同程度的破坏。这种破坏会导致抗体分子内部及结构域之间的相互作用被削弱，使其构象变得更加灵活，甚至发生局部去折叠。一旦去折叠发生，通常被包裹在分子内部的疏水域便会暴露出来，进而促使抗体分子之间发生诸多非天然的不可控相互作用，这种相互作用可能成为聚集的起点，并逐步发展成为可见的聚集体。
此外，洗脱过程中还有一个不可忽视的因素：抗体浓度非常高，而高浓度本身就是促进聚集的推手之一。因为浓度越高，分子之间发生疏水碰撞的概率就越大。虽然酸性洗脱在Protein A层析中不可避免，但这一步骤在整个纯化流程中风险极高——如果不能精确控制条件，很可能诱发大量聚集体的生成。对于治疗性抗体而言，这个问题尤为严重。因为聚集体不仅会降低药物的生物活性，还可能在被注入患者体内后，引发严重的免疫原性反应，一旦残留，将构成重大的安全隐患。
为了深入理解聚集体的形成机制并探索其抑制策略，本研究以Antibody X——一种已知特别容易聚集的单克隆抗体为模型分子，系统评估了不同洗脱条件下对其聚集行为的影响（表1，图1）。
本研究中的所有实验均采用高性能Protein A填料WorkBeads affimAb Edge，在标准操作条件下进行，上样量为填料动态结合载量（DBC）的70%。Antibody X的样品来源为澄清的CHO细胞上清液，抗体浓度约为5 mg/mL。洗脱液中的聚集体含量通过分析型排阻层析（SEC）对各收集组分进行检测，并以高分子量物质（HMWS）的百分比进行定量评估。
表1. 本研究中使用的单克隆抗体 Antibody X 的生化特性
图1. 研究中使用的 CHO 细胞上清液的分析型 SEC 图谱。星号（*）标示目标单抗。
洗脱pH的影响
为了找出最适合Antibody X的洗脱条件，我们首先在pH 2.7至4.0的范围内进行了一系列测试。如图2所示，实验结果符合预期：pH越低，洗脱液中高分子量物质（HMWS）的比例越高，即聚集体水平越高；而随着pH升高，HMWS水平呈下降趋势。
除了聚集体水平，洗脱峰宽也是衡量洗脱效率的重要指标之一。窄的洗脱峰意味着目标蛋白集中在一个较小的体积范围内被回收，后续处理更省时省力。理论上，pH越低，洗脱强度越大，峰形应当更窄。实验中pH 4.0的峰形确实呈现出明显的宽化和拖尾——很可能是酸性不足导致抗体未能从Protein A上彻底释放所致。
但有趣的是，pH 3.5与pH 2.7的表现并未完全遵循这一规律。pH 3.5的洗脱峰不仅比pH 2.7更窄，而且HMWS水平也更低。也就是说，在本次实验中，pH 3.5同时兼顾了高效的洗脱和较低的聚集风险，是一个更理想的操作条件。这也引出了一个值得深思的问题：为什么在这个案例中，pH 3.5反而比酸性更强的pH 2.7表现更好？
图2. 单抗洗脱及相应洗脱液中 HMWS 水平的 pH 依赖性。pH 2.7、3.5 和 4.0 的结果。
机理洞察
为了进一步厘清影响峰形、聚集体水平和收率的深层因素，我们在后续实验中引入了另一种缓冲体系——甘氨酸-HCl（glycine-HCl），并与柠檬酸盐（Citrate）缓冲液在pH 3.0、3.2和3.5下进行了系统对比（图3）。
有趣的是，两种缓冲体系下的峰形变化趋势正好相反：柠檬酸盐缓冲液的峰形随pH升高而逐渐变窄；而甘氨酸-HCl则恰恰相反，随pH升高反而出现峰宽化（图3A）。
在HMWS水平方面，两种缓冲液的表现均符合“低pH高聚集”的总体趋势，即pH越高，HMWS水平越低。但值得注意的是，在相同pH条件下，柠檬酸盐缓冲液产生的HMWS水平略高于甘氨酸-HCl。这可能与两种缓冲液体系下洗脱总体积不同有关——洗脱体积的大小直接影响了收集液中抗体的浓度，进而可能影响聚集体的生成（图3B）。
那么，为什么会出现完全相反的峰形变化趋势呢？
对于柠檬酸盐缓冲液而言，峰宽化与HMWS水平的升高密切相关。通过对洗脱峰的逐管分析（图4）可以发现，HMWS主要在峰的拖尾区域富集。一个可能的解释是：较低pH下产生的聚集体更多，而这些高分子量复合物在层析柱中迁移较慢，更容易滞留在峰尾，从而导致峰形不对称地展宽。
而甘氨酸-HCl的峰形变化则与其缓冲体系本身的特性有关。在Protein A层析中，pH降低是洗脱的主要驱动力，因此pH过渡的方式直接影响洗脱效率。当洗脱缓冲液进入层析柱后，大约在0.9倍柱体积时突破，pH和电导率随之发生变化。监测pH和电导率的动态过程，可以观察到柠檬酸盐和甘氨酸-HCl两种缓冲液在柱内传播方式的显著差异。
结果讨论
对于柠檬酸盐而言，在洗脱峰的早期阶段，pH的变化与电导率的下降几乎同步（如图4A中pH 3.5的柠檬酸盐所示）。这表明洗脱缓冲液以相对均匀的方式通过层析柱，pH下降平稳、可控，抗体得以迅速解吸，形成窄且对称的洗脱峰。
相比之下，甘氨酸-HCl的表现则截然不同（图5）。洗脱缓冲液突破后，pH并非立即下降，而是出现一个“过冲”——先升高至碱性区域（>7.4），随后才缓慢回落至目标pH。与此同时，电导率则先降后升，整体变化曲线呈现出明显的时间滞后。
这种滞后现象与甘氨酸的化学特性有关。在过冲阶段的高pH条件下（>7.4），甘氨酸主要以两性离子形式存在，对电导率的贡献极小；当pH逐渐稳定至目标值（3.0或3.5）时，甘氨酸被质子化，电导率随之小幅上升——这种效应在更低pH下更为明显。
进一步分析认为，pH过冲可能是由甘氨酸阳离子与Protein A配基上带负电残基结合的钠离子之间发生离子交换所致[1]。这种相互作用延缓了pH前沿在柱内的传播。同时，甘氨酸-HCl在目标pH范围内的缓冲能力较弱，进一步拉长了pH平衡所需的时间。pH下降的延迟直接导致抗体解吸延迟，洗脱峰随之宽化。而在更高pH下，甘氨酸-HCl的缓冲能力更弱，过冲现象更严重，峰形也更宽——这正好解释了图3B中pH 3.5比pH 3.0表现更差的原因。
综合以上结果，我们最终选择pH 3.5的柠檬酸盐缓冲液作为Antibody X的最优洗脱条件。这一条件不仅洗脱峰形最窄、收率高，而且HMWS水平适中，可在后续精纯步骤中有效去除。
Protein A 填料的性能比较
在确定了pH 3.5柠檬酸盐缓冲液为最优洗脱条件后，我们进一步对比了WorkBeads™ affimAb Edge与另外两款市售Protein A填料——MP和MS70——在纯化Antibody X时的整体表现。
结果显示，三种填料在洗脱峰形上并无显著差异，均表现出良好的洗脱效率。但在对洗脱液的进一步分析时发现，WorkBeads™ affimAb Edge在关键指标上具有明显优势。
从SEC图谱（图6A）来看，三种填料的洗脱液中均以单体为主，说明目标抗体得到了有效捕获和回收。其中，WorkBeads™ affimAb Edge洗脱液中的高分子量物质（HMWS）水平最低（图6B），表明其在捕获阶段对抗体聚集的控制更为出色。在收率方面，三种填料均达到了90%以上的高回收率（图6C），但WorkBeads™ affimAb Edge的收率超过95%，且在SDS-PAGE分析中展现出最高的纯度（图6D）。
综合来看，三种填料在洗脱峰形上旗鼓相当，但在洗脱液的最终品质上，WorkBeads™ affimAb Edge提供了更高的收率、更低的HMWS水平和更好的纯度，这使其在提升抗体纯化工艺的生产效率和产品质量方面具备实实在在的潜力。
结 论
洗脱缓冲液的选择和pH设定，对Protein A亲和层析的整体表现有着举足轻重的影响——这两者共同决定了聚集体水平和洗脱峰形这两个核心指标。而贯穿其中的核心矛盾，正是我们在本文中反复提及的“洗脱两难困境”：必须使用足够低的pH才能有效释放抗体，但低pH本身又会不可避免地促进抗体聚集。
本研究以易聚集单抗Antibody X为模型，系统评估了不同洗脱条件的影响。结果表明，低pH确实会加剧聚集；同时，缓冲液的化学组分并非中性角色——它会显著影响pH在柱内的传播方式，进而改变洗脱曲线的形态。柠檬酸盐缓冲液能提供均匀的pH过渡和窄而对称的洗脱峰，而甘氨酸-HCl则因pH过冲和传播延迟，导致峰形宽化。
在这一优化条件下，来自Bio-Works的WorkBeads™ affimAb Edge与市售Protein A填料MP和MS70相比，WorkBeads™ affimAb Edge不仅收率更高，HMWS水平也更低。
这些结果充分说明，WorkBeads™ affimAb Edge能够在保证高回收率的同时，更有效地抑制抗体聚集，为单抗纯化工艺带来更高的生产效率和更好的成本效益。
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参考文献
1. Hahn R, Berger L, Beck J, Carta G. pH and conductivity transients during elution of IgG from protein A columns. Biotechnology Progress. 2025 May-Jun;41(3):e3534. doi: 10.1002/btpr.3534.
